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Realidades, novedades y expectativas del Chip de ADN
El ADN y la genética en general albergan grandes expectativas y realidades en cuanto a las aplicaciones de las nuevas tecnologías y descubrimientos. Los científicos y médicos, están en continua búsqueda de aplicaciones, ya sea en la paternidad, la forénsica o la identificación de personas, sin olvidar posibles curas a desórdenes genéticos y enfermedades. En este punto, tanto el Chip de ADN, como los Biochips y los microarrays son las puntas de lanza del futuro genético aplicado junto con las células madre.
Micromatrices y ADN Chips
El análisis de micromatrices de ADN se utiliza en la biología molecular y la medicina de diagnóstico para determinar qué genes en una célula se activan en un momento dado en el tiempo. Esta técnica se conoce como un ensayo múltiple, ya que puede medir miles de muestras en un solo ensayo. técnicas de ADN microanálisis se utilizan para interpretar datos de ensayos realizados en el ARN y el ADN, en función de las necesidades particulares del experimento. La base del análisis de microarrays de ADN es la alta especificidad de las moléculas de ADN, y la capacidad de elegir las secuencias únicas de ADN para representar un determinado gen. Un experimento de análisis de microarrays se lleva a cabo sobre una superficie sólida a partir de un vaso o un chip de silicona en el que se establece una matriz química. En la superficie de la matriz de ADN o ARN sondas se alinean en filas ordenadas.Una vez que el ADN chip se ha creado con las sondas necesarias, las células en estudio están preparados. Para preparar las células, que hay que romper abierto para que los ácidos nucleicos que contienen pueden ser aislados. Una serie de reactivos se añaden a extraer y concentrar los ácidos nucleicos contenidos dentro de las células. A continuación, el extracto de ácidos nucleicos se añade al chip, que se deja durante varias horas para dar tiempo a que las sondas de interactuar y unirse a los ácidos nucleicos celulares. Por último, una nueva serie de reactivos se agregan a la viruta para identificar los lugares en los ácidos nucleicos celulares se han unido a las sondas.
Análisis de Microarray
El análisis de Microarray se utiliza para determinar qué sondas han sido capaces de detectar los ácidos nucleicos celulares. Esto es a menudo un análisis complejo, como un solo chip puede contener decenas de miles de sondas única. El orden de las sondas en el chip se almacena en una base de datos informática para que los resultados se pueden obtener fácilmente. Usando el chip y base de datos, un científico puede elaborar una lista de genes que han obligado a las sondas y por lo tanto presentes en el extracto celular original. La técnica de análisis de microarrays se utiliza comúnmente en perfil de expresión génica. En este tipo de experimento, los microarrays está configurado para examinar los patrones de expresión génica en las células. Sondas para los genes de interés se incluyen en la micromatriz, y cuando el experimento se ha completado, el análisis de datos de microarrays puede determinar cuál de los genes en estudio se encendieron en un momento determinado.Otros usos de esta técnica incluyen la hibridación genómica comparada y la detección de SNP. Hibridación genómica comparativa es una prueba que examina el contenido de genómica en las células de los organismos relacionados. Este tipo de ensayo proporciona información sobre las relaciones genéticas entre especies diferentes. detección de SNP es una técnica que puede ser utilizado en el análisis forense, análisis de ligamiento genético y evaluación de los riesgos de enfermedades genéticas. Los SNP son polimorfismos de nucleótido único, localizaciones en el genoma en la que hay dos posibles secuencias de pares de bases. SNPs pueden proporcionar una gran variedad de información genética útil debido al hecho de que existen diferentes variaciones de SNP en diferentes poblaciones étnicas y geográficas.
A unos pocos científicos la vida puede llorar el paso de los días en que el concepto de "un gen, un" experimento controlado su vida profesional. Pero la mayoría de sus colegas han acogido con satisfacción la llegada de los chips de ADN y microarrays que ofrecen a los investigadores la oportunidad de ejecutar miles de muestras de forma simultánea en un solo experimento con condiciones prácticamente idénticas. La industria de la farmacéutica en particular, valores el uso de la tecnología del microarray para detectar un número creciente de moléculas en volúmenes más pequeños como los fármacos candidatos. "Hay un tremendo entusiasmo acerca de la tecnología", dice Alex Szabo, vicepresidente de Stratagene. "Todos se dan cuenta que es una de las tecnologías clave en la era genómica."
Robótica y avances en el ADN y genética
Los observadores pueden usar el pin, de chorro de tinta y otras tecnologías para depositar las muestras sobre el material de apoyo. Varios de los métodos más comunes utilizan patillas de metal, que puede ser sólido o dividido. Cuando los pines se sumerge en los pozos que contienen los compuestos de interés, cada uno coge una pequeña cantidad del material. El pin es entonces puesto en contacto con el sólido respaldo y un volumen nanolitros se dispensa en el lugar deseado. En las clavijas (también conocido como púas) una ranura de corte en la cabeza de las funciones del terminal como un reservorio para el compuesto de ser descubierta. Pluma de alfileres se utiliza con mayor frecuencia con las diapositivas de cristal, mientras que los pines sólidos se utilizan normalmente para detectar las membranas.Amersham Pharmacia Biotech, GeneMachines, y otras empresas ofrecen manchado robots. "Somos proveedores de equipos para los científicos a imprimir sus propios arreglos", dice Elmes de Biorobótica. "Nuestra tecnología puede hacer que un gran número de matrices, en el rango de cientos de miles o millones. Pero es más adecuado para el número medio de cientos a miles o decenas de miles de matrices. También es más flexible que muchos en el mercado. Usted puede hacer arreglos con oligonucleótidos, PCR productos, las proteínas, o lo que quieras. " MiraiBio, por su parte, ha desarrollado un observador basado en una patente pendiente el diseño pin propiedad originalmente destinados a la industria de semiconductores. "Se sostiene un globo perfecto de líquido en el extremo de la punta por cuatro elementos, resultando en forma de punto de constante", explica Lee. "Es por resorte, algo así como un bolígrafo. Se da a los científicos la capacidad de controlar la velocidad y detectar donde golpea. Nuestro arrayer le permite realizar varios ajustes, x, y y z, de modo que las superficies que pueden ser puntos muy flexible. Se puede usar en superficies de las membranas muy frágiles, por ejemplo. "
Chips, Microarrays y aplicaciones de las computadoras
MicroSystems Genéticos, mientras tanto, ha desarrollado un pin único y tecnología de anillo. Debido a que es menos sujeto a la obstrucción de púas o clavos, este método es más adaptable a diferentes tipos de matriz que los investigadores desearan formular.La tecnología de inyección de tinta proporciona otro método de localización de microarrays. Adaptado de la industria de la impresión y con nuevo diseño para su utilización en aplicaciones biotecnológicas, este utiliza osciladores piezoeléctricos de cristal y un sistema de guía de electrodos para depositar el compuesto en una ubicación exacta en la diapositiva o membrana. Las compañías tales como Tecnologías cartesiana y Laboratorios ProtoGene utilizar esta tecnología. spotter ProtoGene, por ejemplo, pueden depositar los nucleótidos individuales para formar oligonucleótidos in situ (es decir, en el chip). Uso de las cabezas de impresión por separado para cada base elimina la contaminación cruzada de los nucleótidos. Además esta tecnología produce manchas muy consistente en tamaño y funciona a una velocidad muy alta. Agilent, aprovechando su patrimonio de Hewlett-Packard, también utiliza la tinta aviones tanto para depositar oligos presynthesized y productos de la PCR y, utilizando un sistema de escritor diferente, para depositar los nucleótidos individuales para crear secuencias de interés en lugares predefinidos.
Affymetrix, el líder del mercado en microarrays de ADN, utiliza un método propio de la fotolitografía. La compañía basa su planteamiento en las máscaras de fotolitografía similares a las utilizadas para producir chips de computadora. Las máscaras de control de la eliminación sensible a la luz de los grupos de protección química de hidroxilos en las regiones de la diapositiva que no están enmascaradas. Esto permite que los nucleótidos modificados para reaccionar con bases en la solución de la reacción a crecer la secuencia de ADN. El proceso se repite hasta que se produce secuencias de ADN de 20 a 25 bases de longitud. Este sistema produce muy microarreglos de ADN chip de alta densidad. Es bastante caro en términos absolutos, aunque la competencia en términos de precio por bit de información. Cambiar o modificar la máscara de fotolitografía también lleva su tiempo, y llega en algún costo significativo.
Grandes productores de Chips de ADN y Microarrays
Affymetrix a la vanguardia en la producción a gran escala de los microarrays de ADN. "Debido a que son capaces de tomar ventaja de las técnicas de fabricación de semiconductores, somos capaces de hacer en cualquier lugar 40 a 400 GeneChip matrices individuales de una sola vez", explica Fodor. "Para satisfacer la creciente demanda de nuestros productos, hemos aumentado considerablemente nuestra capacidad de fabricación con la realización y validación de una segunda fábrica. La capacidad de fabricación de este nuevo servicio está diseñado para mantener el ritmo de la demanda futura."Affymetrix ofrece una amplia gama de productos y servicios de su sistema de GeneChip norma a los servicios personalizados para los científicos que tienen presupuestos que les permiten comprar los microarrays de ADN a medida de un proveedor comercial. La compañía también ha ayudado a obtener acceso a la academia a los investigadores a estos chips mediante la creación de una estructura de precios académicos, que permite a la universidad y los laboratorios sin fines de lucro para acceder a estos productos.
Un equipo científico en NimbleGen ha desarrollado un nuevo método in situ arraying similar enfoque fotolitográfica de Affymetrix. Se diferencia, sin embargo, en que no requiere el uso de máscaras de fotolitografía. "La principal diferencia es la forma en que el patrón de la luz", explica Roland Green, presidente de la compañía vicepresidente y director de tecnología. Este nuevo "sin máscara" La tecnología utiliza un sistema de espejos diminutos de Texas Instruments. Dirige la luz ultravioleta para cada píxel deseado simplemente cambiando la posición de los espejos individuales en el sistema. Estos espejos de control de la trayectoria de la luz y en última instancia, determinar qué píxeles se activará para la síntesis de ADN. "El proceso nos permite rediseñar un chip en cuestión de horas", dice Green. "Los chips son más baratos y más rápida de producir."
Este sistema de micromatrices de ADN sin máscara tiene especial interés para los científicos debido a que la vida les puede proporcionar una gran flexibilidad y personalización en la producción de sus microarrays. En lugar de hacer una nueva máscara fotolitográfica cada vez que el microarray de ADN es cambiado o modificado, este sistema requiere que el usuario sólo tiene que volver a programar los espejos. Esta acción vuelve a dirigir la luz a los píxeles diferentes en el chip.
Sede en San Francisco Mergen Ltd. presentó lo que llama el ExpressChip (TM) sistema de microarrays en octubre de 1999. La compañía fabrica los chips en la rata humana, y todos los formatos múltiples del ratón. El sistema contiene dos láminas idénticas de microarrays de vidrio, reactivos clave para la hibridación y la detección y un manual de instrucciones detalladas. Cada diapositiva es prespotted con secuencias de ADN funcionalmente importantes para el metabolismo celular y / o desarrollo de la enfermedad. "Somos la única empresa que utiliza oligos visto", dice Qian Jin Hu, presidente y CEO de Mergen. "Creemos que esto tiene una ventaja mucho más del control de calidad. Nosotros prepurify los oligos, lo que da un mejor control de calidad que para la preparación in situ. Y el costo y la viabilidad son mejores."
Corning ha entrado en el campo con lo que denomina matrices índice de 10.000 o más genes. La idea es crear una plataforma menos rígidos que los disponibles comercialmente en la actualidad. "Nuestro tema inicial está mirando de perfiles de expresión para las personas que quieren hacer la identificación de objetivos", dice Jeff Mooney. "En este momento tenemos una matriz de levadura en el mercado. Nuestros planes ahora son introducir un producto matriz humanos durante el segundo trimestre de este año".
Características de los Chips de ADN
Sin embargo su pureza y alta calidad de manchas, un microarray, ésta pierde su valor sin un método eficaz de la lectura de sus resultados. "La capacidad de la imagen lo que tienes es muy importante", dice Lee MiraiBio es. "Los factores que incluyen son la sensibilidad del instrumento, su resolución y la capacidad de obtener una profundidad focal adecuada. La velocidad de barrido es también un factor crítico para las instalaciones básicas." El método de detección de la señal se utiliza con los chips de ADN depende del tipo de etiqueta que se utiliza en un experimento. Los métodos comunes de etiquetado incluyen fluorescentes, radiactivos, y los enfoques enzimática. Las empresas que ofrecen sistemas de este tipo incluyen Axon Instruments, MicroSystems Genéticos, Genomic Solutions, y MiraiBio.Estas etiquetas fluorescentes son detectadas con escáneres láser confocal diseñado específicamente para su uso con microarrays de ADN. Estos escáneres pueden eliminar la fluorescencia de fondo no deseado, al limitar el ámbito en que el sistema capta las señales a las regiones por encima del plano de la matriz donde se encuentra el sustrato. Esto reduce al mínimo la detección de señales fluorescentes perdida del sustrato, las partículas de polvo, o el propio de diapositivas. Estos escáneres suelen incluir software para el análisis e interpretación de los datos.
Las etiquetas radiactivos pueden ser reflejados con un phosphorimager o la película autorradiografía mucho menos glamoroso, pero sigue siendo efectiva. El radiolabels más comunes para este procedimiento son el fósforo 32P y 33P isótopos. Ambos tienen ventajas y desventajas. 32P produce una señal más fuerte y menos gastos. El más caro 33P produce una señal más débil pero puede ser utilizado en un rango mayor. Radiolabels más a menudo se utiliza con macrochips membrana de nylon, como las ofrecidas por Clontech.
Un método de detección tercio usa con menos frecuencia que los otros dos. Grupos de investigación puede aplicarse a la detección enzimática nylon macrochips membrana. los sistemas enzimáticos se basan generalmente en un espectrofotómetro para automatizar el proceso de detección. Alternativamente, un científico puede inspeccionar el resultado visualmente. Ambos sistemas de visualización de biotecnología Genzyme y llevar a los sistemas para la detección enzimática.
Una cuestión de interpretación del ADN
Una vez que completen un experimento con microarreglos de ADN chip de ADN, los científicos necesitan para interpretar sus lecturas. Microarreglos de ADN chip con miles de muestras o manchas pueden producir grandes volúmenes de datos. El almacenamiento y el análisis de estos datos puede causar un grave obstáculo en la investigación de laboratorio. De hecho, algunos investigadores esperan realizar experimentos primera matriz con los chips más grandes integral, tales como el gen de Affymetrix en un chip de productos, y luego hacia abajo-el tamaño de sus esfuerzos de investigación, centrándose en una familia específica de genes.Esta forma de operar se debe en parte a la complejidad de trabajar con grandes volúmenes de datos. "La mayoría de los investigadores de entrar en el campo no están acostumbrados a tratar con grandes conjuntos de datos, a menudo en un gran número de muestras. No pueden estar en condiciones de obtener rápidamente los resultados pertinentes de estos grandes conjuntos de datos", dice Michael Kane de Genomic Solutions. "Ellos pueden averiguar más tarde que su diseño del estudio y la estrategia de análisis de datos no se ajustan a sus objetivos de investigación en general".
Algunos investigadores han asociado con los programadores de computadoras para desarrollar una herramienta informática propia para sus esfuerzos de investigación individual. Esto no es una tarea fácil, sin embargo. Un programador que quiera entender la sutileza de interpretación de los datos biológicos deben tener un duro-a-adquirir familiaridad con la biología y algunas veces con el diagnóstico clínico. Los científicos que tienen una sólida formación en programación de computadoras cada vez más se encuentran en alta demanda como reclutas para el nuevo campo de la bioinformática.
BASF Leming Shi es un ejemplo de las cualidades necesarias para interpretar los experimentos de microarrays. Entrenado como un modelador molecular, ganó su primer contacto real de ciencias de la vida durante su investigación post-doctoral. "Me quedé sorprendido por lo mucho que se vendió en la biología", recuerda. "Mi interés ahora está en tener los conocimientos a partir de datos de microarrays para el descubrimiento de genes, el descubrimiento de fármacos, o de investigación. Mi objetivo es integrar la bioinformática y la quimioinformática".
Código de programación de Chips de ADN
Los científicos poco entusiasta acerca de cómo escribir código de programación tienen una alternativa. Varios proveedores de software comercial han desarrollado para analizar e interpretar los datos de microarrays de ADN. Affymetrix, Lion Bioscience, Spotfire y Genética del silicio, entre otros, ofrecen paquetes de software para este propósito. Sin embargo, Shi advierte contra el peligro de exceso de mezcla y combinación. "El campo no está aún en una fase muy madura, incluso en la representación de los datos moleculares", dice. "Los fabricantes tienen normas diferentes y un montón de empresas han plataformas diferentes. Lo que está disponible en el mercado no siempre puede hacer lo que el departamento de necesidades individuales o de grupo". La consecuencia: "Cada grupo tendrá que desarrollar su propio software para los próximos años", dice Shi.El área de la informática no es el único segmento de microarrying que se beneficia de la normalización. "Lo que es evidente que faltan son las normas técnicas para la comparación de diferentes sistemas", dice Lee, de MiraiBio. "Hay varias tecnologías diferentes en el mercado", añade Elke Zimmermann, gerente de productos de Eppendorf. "Nuestra sensación es que la producción de matrices no es el único paso crítico. También es importante examinar con detalle todos los aspectos de los arreglos, incluida la preparación, etiquetado y análisis de datos, para saber lo que está haciendo exactamente. Es muy importante tener en cuenta en el control de calidad y normalización. "
Dirk Vetter, director general de Farmacia Graffinity de diseño, se hace eco de ese pensamiento. "Los científicos están preocupados por la calidad de los datos de microarrays", dice. "No hay muy buena manera de validar si se han producido buenos datos o datos débiles. El campo se enfrenta al peligro de tomar decisiones que involucran a gastar mucho tiempo y dinero sobre la base de datos posiblemente pobres. Se necesita un filtro de seguridad porque usted tiene que disponer de datos sólidos como una roca. "
La cuestión ha llegado más allá del laboratorio. "La estandarización es definitivamente un problema ahora. En una reciente conferencia en Alemania, el debate se centró en el hecho de que los investigadores no siempre creen en los resultados de otros grupos, ya que están utilizando sus propios métodos y normas", recuerda Zimmermann. "Hay algo de duda en unirse al club y ser francos acerca de los resultados," de acuerdo Vetter.
Problemas con la estandarización en el Chip de ADN
Los científicos que participaron en la disciplina han hecho más que quejarse de la falta de estandarización. "Puedo escuchar a la gente diciendo en voz muy alta que les gustaría formar un comité o un consorcio para establecer normas sobre la calidad de los datos de las matrices", dice Vetter. "Los comités son de antemano, pero se requerirá un gran esfuerzo a largo plazo y representan un reto técnico." Algunas compañías ya han comenzado a enfrentar el reto. Affymetrix, por ejemplo, instituyó controles internos desde el inicio de su fabricación. "Ellos depurar temprana", dice Vetter. "Eso puede darles la oportunidad de salir como un estándar". Fodor agrega que el proceso de fabricación de la empresa, de apalancamiento de la tecnología de producción de semiconductores, los permisos para hacer las matrices de obleas y de ejercer control de calidad de cada lote.Los temas de las normas y control de calidad tienen un impacto más evidente en ciencias de la vida que deciden seguir su propio camino en la preparación de microarrays. De hecho las universidades y las empresas farmacéuticas y biotecnológicas ahora hacen la vida más fácil para los científicos como de lo que solía ser hace años una media docena. Grupos de investigación y departamentos en laboratorios académicos han unido sus fuerzas para crear instalaciones de la base para el diseño de microarreglos de ADN chip de ADN, la producción y análisis aún. Estas instalaciones pueden proporcionar una gran cantidad de los conocimientos técnicos necesarios para el trabajo de microarrays. En particular, eliminar la amplia capacitación que cada investigador individual requiere antes de emprender el trabajo de microarrays de pleno derecho. El concepto básico instalación también permite a los investigadores individuales para trabajar juntos y compartir los costes de esta gran inversión financiera necesaria para la producción y otros instrumentos de microarreglos de ADN chip necesario.
Sin embargo, las instalaciones principales tienen sus limitaciones. "Siempre habrá gente que le gusta tener el control de su propio funcionamiento", dice Chris Bailey, gerente de producto de matrices génicas de Sigma-Aldrich. Así que los sistemas de los investigadores académicos de varias seguir para crear y utilizar "hágalo usted mismo" para producir sus propios chips de ADN en el laboratorio. De hecho, dice Szabo Stratagene, "La gran mayoría de los experimentos se hacen con matrices" hágalo usted mismo ".
Estas se basan principalmente en el sistema robótico manchado originalmente desarrollado por Patrick Brown por su laboratorio de Stanford. Brown ha hecho desde entonces los protocolos de su tecnología de fabricación casera a disposición de otros laboratorios para que puedan producir sus propios microarreglos de ADN chip de ADN. Poco después de la aparición de la tecnología de microarrays comercial, varias empresas empezaron a ofrecer sistemas de localización para el uso de vinos locales. El ADN y la genética en general albergan grandes expectativas y realidades en cuanto a las aplicaciones de las nuevas tecnologías y descubrimientos. Los científicos y médicos, están en continua búsqueda de aplicaciones, ya sea en la paternidad, la forénsica o la identificación de personas, sin olvidar posibles curas a desórdenes genéticos y enfermedades. En este punto, tanto el Chip de ADN, como los Biochips y los microarrays son las puntas de lanza del futuro genético aplicado junto con las células madre.